P3 B. Hoffmann, R. Merkel, P.F. Huesgen

Dehnungsstress-induzierte Autophagozytose: Substrate und Selektionsmechanismen

Mechanosensorische Proteine spielen für die Erkennung mechanischer Signale, speziell Dehnung, und die Anpassung an veränderte Umgebungsparameter sowohl auf Einzelzellebene als auch in Geweben eine herausragende Rolle. Mechanosensorische Proteine setzen diese Dehnung meist durch Öffnung ihrer Tertiärstruktur und Bindung von Proteinpartnern oder Phosphorylierung in eine chemische Signalkaskade um. Nachfolgend erfolgt typischerweise ihre Rückfaltung. Großenteils unklar bleibt jedoch ihr Schicksal bei fehlerhafter Rückfaltung, wie sie bei starken Dehnamplituden oder zyklischer Dehnung erfolgen kann. Wir konnten eine Aktivierung autophagosomaler Prozesse unter zyklischer Dehnung nachweisen. Die Anzahl gebildeter Autophagosomen korreliert zeitlich mit der Stärke des Stresses, der durch Dehnung an die Zellen angelegt wird. Reorientierung der Zellen als Zellantwort zur Reduktion des Stresses geht mit einer gleichzeitigen, eng gekoppelten Reduktion gebildeter Autophagosomen einher. Blockierung des autophagosomalen Abbaus mindert dieses Reorientierungsverhalten. Die Autophagosomenbildung korreliert zudem mit der Anzahl mechanosensitiver Strukturen, insbesondere Stressfasern und Zell-Matrix-Adhäsionen. Mechanosensitivität, Stressantwort und Autophagosomenbildung scheinen hierbei zentral durch BAG3 beeinflusst zu werden, ohne dass dadurch die Gesamtproteinmenge der sensorisch aktiven Proteine maßgeblich beeinflusst wird.

Aufbauend auf diesen Ergebnissen werden wir den Zusammenhang zwischen der Stärke des Aufbaus mechanosensitiver Proteinkomplexe, mechanosensitiver Antwort und Autophagie sowohl für zelluläre als auch gewebsspezifische mechanosensitive Komplexe detailliert untersuchen. Komplexbildung sowie Autophagie werden ergänzend gezielt aktiviert oder inaktiviert. Autophagosomal abgebaute Proteine werden durch Autophagosomen-Anreicherung unter unterschiedlichen Stressbedingungen mittels massenspektrometrischer sowie Immunoblot-Analysen charakterisiert. Zusätzlich werden die Interaktome von BAG3- und mehreren HSPBs in unterschiedlich gestressten Myotubes bestimmt, um die Autophagie-Induktionsmechanismus zu charakterisieren. Veränderungen der Austauschkinetik mechanosensitiver Proteine werden mittels FRAP unter Bedingungen maximaler Autophagosomenbildung untersucht. Der Einfluss einer Blockierung der Autophagie sowie Mutanten der CASA Maschinerie (z.B. BAG3-WAWA) und BAG3-Phosphomutanten auf Austauschkinetiken und zelluläre Mechanoresponse wird untersucht. Zusätzlich wird die Stressantwort im Soleusmuskel der Ratte mit einem bereits entwickelten Gewebestretcher charakterisiert. Neben der Verifizierung bereits auf Zellkulturebene bekannter oder neu identifizierter Verbindungen zwischen Stressapplikation und Autophagie wird im Gewebe der Frage nachgegangen, inwieweit sich elektrisch induzierte Kontraktion (negative strain) und Dehnung (positive strain) in Bezug auf ihren Einfluss auf mechanosensitive Proteine und Autophagie unterscheiden.